CHIMICA COMBINATORIA

Chimica combinatoria

di Pierfausto Seneci

Si indica con tale locuzione l'utilizzo di strategie e protocolli sperimentali ad alta produttività volti a massimizzare le reazioni di sintesi chimiche e, quindi, produrre un gran numero di composti, che vanno a formare le cosiddette librerie. Si sfrutta, a tale scopo, la permutazione esaustiva dei reagenti utilizzati per effettuare una trasformazione chimica. L'introduzione nella ricerca farmaceutica delle cosiddette tecniche di saggio ad alta numerosità, o ad alta capacità (High throughput screening, HTS), ha automatizzato e miniaturizzato i processi, permettendo ai ricercatori di realizzare fino a svariate migliaia di composti al giorno. Alla chimica medicinale è stato richiesto di bilanciare la capacità dell'HTS sviluppando tecniche di sintesi ad alta numerosità che permettessero di produrre molti composti in quantità minima, con grande purezza e in tempi molto rapidi. Per es., la condensazione di 100 acidi e 100 ammine diversi produce, attraverso tutte le possibili combinazioni dei reagenti, una libreria composta da 10.000 ammidi ognuna delle quali strutturalmente diversa dalle altre. A partire dai primi tentativi della fine del 20° sec., la c. c. applicata alla ricerca farmaceutica si è evoluta e ampliata notevolmente, passando dalla sintesi di librerie oligomeriche (peptidi, nucleotidi) a quella di librerie di molecole organiche più o meno complesse fino ad arrivare a librerie di derivati di prodotti naturali complessi.

Sebbene l'applicazione farmaceutica sia ancora la più conosciuta e affermata, tecniche sintetiche combinatoriali sono diventate di uso pressoché comune anche in altre aree. Fra esse si possono ricordare la catalisi, la chimica sopramolecolare, la biotecnologia e la diagnostica, la scienza dei materiali. In queste aree i più disparati formati di librerie organiche, inorganiche e biologiche hanno dimostrato la loro utilità accelerando la scoperta di nuovi principi attivi e hanno inoltre fornito a ricercatori accademici e industriali la possibilità di portare a compimento progetti di grande rilevanza scientifica.

Definizioni

fig. 1B

Una libreria combinatoria è la singola unità con cui si ha a che fare in chimica combinatoria. Essa è costituita da un numero di componenti che può andare da alcune decine fino a molti milioni e può essere preparata in vari formati, utilizzando diversi protocolli sperimentali combinatori, parzialmente o totalmente automatizzati: per es., 100 reazioni di ammidazione fra 10 ammine e 10 cloruri acidi possono essere eseguite simultaneamente per dare i 100 prodotti sotto forma di libreria pronta per l'uso, mentre le stesse reazioni se fossero eseguite in maniera sequenziale (fig. 1B) richiederebbero tempi e sforzi sintetici molto più rilevanti.

fig. 2A

Una libreria organica (fig. 1) è composta da molecole organiche ed è preparata usando reazioni di chimica organica; una libreria inorganica (fig. 2A) è costituita da composti inorganici ed è preparata con tecniche di chimica inorganica e di chimica dei materiali; una libreria biosintetica (fig. 2B) o biologica è composta da oligomeri naturali ed è preparata sfruttando l'azione di microrganismi, di fagi o di particolari enzimi o complessi multienzimatici.

fig. 3A

Una libreria primaria (fig. 3A) è composta da molte migliaia di componenti che costituiscono un insieme variato ed è mirata a individuare principi attivi su un bersaglio (o target) del quale poco o nulla è conosciuto; per questo motivo vengono saggiati molti composti significativamente diversi fra loro, sperando che almeno uno di essi mostri l'attività desiderata.

Una libreria focalizzata (fig. 3B) è più piccola (da poche decine a poche migliaia di componenti) e i suoi elementi sono fra loro simili e ispirati a una struttura già nota, la cui attività sul bersaglio di interesse potrebbe essere migliorata.

fig. 4

Il concetto di diversità (o varietà) chimica per una libreria combinatoria non è legato al numero dei suoi componenti, ma piuttosto descrive quanta parte di uno spazio chimico virtuale essa rappresenta: per fare un esempio una libreria di 25 composti disposti uniformemente nello spazio chimico è una libreria ad alta diversità (fig. 4), mentre una libreria più grande ma disposta in una zona specifica dello stesso spazio chimico è una libreria focalizzata a bassa diversità. Nell'esempio qui descritto, la diversità viene misurata in base al peso molecolare e alla lipofilia dei composti; ripartizioni nello spazio chimico basate su altre proprietà sono egualmente possibili. Sia la diversità sia la similarità possono essere valutate tanto fra singole molecole quanto fra i componenti di intere librerie usando moderne tecniche e programmi chemioinformatici.

Una libreria in soluzione si prepara attraverso reazioni chimiche in soluzione, ossia in fase omogenea. Una libreria su fase solida si prepara su supporti polimerici sferici, utilizzando metodologie e reazioni in fase eterogenea. Una libreria di discreti si prepara come un insieme di prodotti distinti e separati attraverso la cosiddetta sintesi parallela, che utilizza strumenti parzialmente o totalmente automatizzati e prevede l'aggiunta contemporanea di diversi reagenti in diversi reattori e la lavorazione simultanea, ossia in parallelo, di ogni reattore di reazione.

fig. 5

Una libreria in miscela, infine, si prepara come un insieme di piccole miscele di composti (pools) ciascuna strutturalmente determinata e contenente parte degli individui che costituiscono l'intera libreria. La struttura generica di una libreria è una formula che rappresenta, attraverso l'uso di radicali non definiti R, la struttura di tutti gli individui componenti la libreria stessa (fig. 5). Un elemento strutturale comune è quello che, essendo presente in ogni componente di una libreria, la contraddistingue strutturalmente; esso può essere un legame chimico iterato, come avviene nelle librerie peptidiche, o un gruppo funzionale, come nelle librerie di ammidi o di esteri, oppure un sistema ciclico, come nelle librerie di benzodiazepine.

Si definisce classe di monomeri un gruppo di reagenti simili, chiamati appunto monomeri, contenenti lo stesso gruppo funzionale che serve, nello schema di reazione che conduce alla sintesi della libreria, a formare un elemento strutturale comune, oppure a decorarlo. Un punto di diversità è una posizione nella struttura generica che varia a seconda del monomero utilizzato per creare un particolare componente della libreria.

Il processo di messa a punto combinatoria adatta le condizioni sperimentali di uno schema di sintesi riferito a una molecola specifica, per poterlo applicare alla preparazione di una libreria combinatoria la cui struttura è ispirata alla molecola stessa. Questo processo può comprendere il trasferimento dello schema di reazione dalla soluzione alla fase solida e l'adattamento delle condizioni di reazione all'uso di monomeri che presentano varie reattività e stabilità. La validazione dei monomeri verifica se ognuno di quelli scelti in una classe è compatibile con lo schema di sintesi combinatoria messo a punto; nel caso in cui la compatibilità non sia verificata, il monomero stesso verrà escluso. Una libreria modello è una versione in miniatura, tipicamente composta da 10÷20 individui, della libreria combinatoria bersaglio di un progetto; essa viene preparata utilizzando lo schema combinatorio messo a punto e viene caratterizzata analiticamente in maniera esaustiva per verificare la presenza e la purezza di ogni componente. Solo se la libreria modello è preparata con successo si passa alla sintesi della libreria bersaglio completa.

Il processo di caratterizzazione analitica di una libreria combinatoria ne determina la qualità mediante l'analisi di un numero statisticamente significativo di discreti (per le librerie di discreti) o di miscele (per le librerie in miscela). Una libreria contenente l'80% dei componenti previsti a un livello adeguato di purezza è una libreria di buona qualità, purché sia noto quali composti formino il restante 20% a bassa qualità, che verrà poi scartato. Il processo di purificazione combinatoria di una libreria sottopone simultaneamente, o in un ridotto numero di cicli iterativi, tutti i componenti della libreria a metodi di purificazione parzialmente o totalmente automatizzati (separazione, estrazione ecc.).

La determinazione ad alta capacità (HTS) dell'attività di una libreria combinatoria misura l'attività sul saggio di interesse per il progetto di ogni componente della libreria (discreto o miscela) contenuto in un pozzetto, o microcontenitore (microwell); il saggio è di natura biologica nel caso di ricerche farmaceutiche, analitico oppure fisico-chimico nel caso di studi riguardanti i nuovi materiali e la catalisi, e così via. La determinazione strutturale ad alta capacità di uno o più composti attivi collega il dato chimico (libreria, struttura degli individui che la compongono) a quello biologico (saggio di ogni composto o miscela di composti) e consente l'accelerazione del processo di scoperta di nuovi principi attivi.

Applicazioni. La ricerca farmaceutica

La ricerca farmaceutica è in continua evoluzione sin dalla sua nascita, con l'ovvio scopo di fornire al paziente farmaci nuovi e sempre migliori. Questa evoluzione, però, ha avuto anche riflessi negativi sulla produttività e sulla competitività delle aziende del settore: ricordiamo, per es., che una maggiore concorrenza e una sempre maggiore attenzione verso i bisogni del paziente da parte degli organismi nazionali e sovranazionali preposti alla tutela della salute possono anche portare a un aumento della documentazione necessaria per la valutazione e la registrazione di nuovi principi attivi. Due dati numerici possono far comprendere come la ricerca farmaceutica rappresenti un settore sempre più competitivo e costoso per le aziende in essa coinvolte. Il costo medio per l'introduzione sul mercato internazionale di un nuovo farmaco è decuplicato, passando dai circa 50 milioni di dollari del 1976 fino a oltre 500 milioni di dollari attuali. Inoltre, il tempo necessario per lo sviluppo di un farmaco, dall'inizio di un progetto di ricerca fino alla commercializzazione del principio attivo, è quasi raddoppiato dal 1960 a oggi, arrivando in media ai 14÷15 anni: considerando che un brevetto ha una vita di 20 anni e che l'elevata competizione del mercato obbliga a brevettare strutture a potenziale attività terapeutica ancora in fase esplorativa, la finestra temporale di sfruttamento esclusivo di un farmaco si è ridotta enormemente. La riduzione dei costi e dei tempi di scoperta e di sviluppo del farmaco è quindi un obiettivo cruciale, perseguito con metodi fra i quali la c. c. ha un ruolo di spicco.

Si usa dividere il processo di scoperta di un farmaco in una fase di ricerca, a carattere più esplorativo, e in una fase di sviluppo, al termine della quale viene ottenuto il farmaco che andrà sul mercato. Mentre lo sviluppo è poco influenzato dall'avvento della c. c. e, più in generale, da altre tecnologie ad alta produttività, la ricerca farmaceutica ne ha tratto considerevole giovamento: vediamo come e dove, esaminando le sue fasi principali.

L'identificazione e la validazione di un bersaglio molecolare sono attività di competenza prevalentemente biologica, nelle quali la c. c. gioca un ruolo di supporto, anche se di recente la commistione fra questa metodologia, genetica e biologia ha aperto enormi potenzialità alla ricerca farmaceutica. Di seguito ha luogo la ricerca di un principio attivo, ossia la sintesi e la valutazione di molte molecole chimiche per determinarne l'attività sul bersaglio molecolare validato. La possibilità di testare un gran numero di molecole preparate in poco tempo e in piccola quantità (meno di 1 mg ciascuna) riduce i costi e i tempi necessari per l'identificazione di principi attivi; queste molecole vengono oggi preparate usando metodiche combinatoriali. Le librerie più adatte a questo scopo sono quelle primarie. All'inizio degli anni Novanta del secolo scorso erano molto utilizzate librerie sintetiche e biologiche composte da macromolecole naturali, per lo più peptidi; spesso erano preparate in miscela, usando il metodo dividi e miscela su fase solida ed erano formate da centinaia di migliaia, se non milioni, di composti. In seguito, sia il basso grado di diversità chimica sia la difficoltà di sviluppare farmaci da principi attivi peptidici hanno spostato l'interesse verso librerie sintetiche composte da molecole organiche caratterizzate da un peso molecolare non elevato, da proprietà fisico-chimiche tali da renderle biodisponibili, da una buona stabilità e da bassa reattività; si tratta di caratteristiche che le rendono sicure, e questo significa che hanno molte più probabilità di diventare farmaci. In aggiunta, le librerie in miscela hanno spesso dato problemi nell'identificazione dei componenti attivi, perché le attività misurate si sono a volte rivelate degli artefatti non riproducibili (falsi positivi) o, viceversa, non sono stati identificati dei prodotti attivi (falsi negativi). Questi e altri inconvenienti hanno portato a privilegiare le librerie di discreti, preparate sia in fase solida sia in soluzione; il numero di individui in esse contenuto, selezionati usando metodi chemioinformatici che garantiscono alla libreria l'alto grado di diversità necessario per esplorare lo spazio chimico utile ad applicazioni farmaceutiche, è calato fino a poche migliaia. Rispetto alla preparazione di librerie polipeptidiche è pertanto necessaria una migliore messa a punto combinatoria per ottenere librerie di piccole molecole organiche; la sintesi di queste ultime implica, infatti, le più svariate trasformazioni chimiche organiche e un gran lavoro sia chemoinformatico sia sperimentale nella validazione dei monomeri scelti fra la gamma di prodotti commercialmente disponibili con le funzionalità chimiche necessarie. Strumenti parzialmente o totalmente automatizzati per la sintesi, la caratterizzazione analitica e la purificazione combinatoria, insieme a nuovi software applicativi, permettono la rapida esecuzione dei passaggi necessari alla sintesi di librerie diverse. Per riassumere, nel corso degli ultimi decenni del 20° sec. l'interesse prevalente si è spostato dalla produzione di singole librerie di centinaia di migliaia di componenti peptidici in miscela su fase solida a quella di decine, se non centinaia, di librerie composte da un numero contenuto di piccole molecole organiche. Ognuna di esse è basata su un diverso nucleo strutturale comune e il loro insieme costituisce una collezione di composti diversi per la ricerca di nuovi principi attivi; la somma dei componenti di queste librerie non eccede la taglia di una sola libreria peptidica a basso grado di diversità.

L'ottimizzazione del principio attivo ne modifica la struttura attraverso la sintesi di analoghi, il migliore dei quali (definito spesso candidato preclinico) possiede non solo una buona attività sul bersaglio molecolare, ma anche un profilo fisico-chimico, farmacocinetico e tossicologico adatto a un farmaco. La sintesi rapida di questi analoghi in quantità ridotte, seppur maggiori rispetto alla fase precedente (quantificabili intorno ai 3÷5 mg per composto), è realizzata al meglio utilizzando di nuovo tecniche combinatoriali. Le librerie più adatte a questo scopo sono le librerie focalizzate. In questo caso si selezionano i componenti della libreria per la loro similarità chimica con il principio attivo da ottimizzare, e al tempo stesso si introducono variazioni strutturali che esplorino le relazioni struttura-attività per il chemiotipo in questione. Il numero dei componenti di queste librerie eccede raramente il migliaio, restando per lo più intorno a poche centinaia; i risultati biologici ottenuti dalla prima libreria focalizzata sono utilizzati per disegnarne una seconda, più ridotta di numero, e così via fino alla selezione di un candidato preclinico. Queste librerie privilegiano la sintesi di discreti, piuttosto che di miscele, operando in soluzione anziché su fase solida. Spesso la loro sintesi è successiva alla preparazione e al saggio biologico di librerie primarie da cui il principio attivo è stato caratterizzato; quindi la messa a punto della strategia sintetica prescelta è ridotta, se non addirittura assente, e tecniche di lavorazione e purificazione più complesse e meno automatizzabili sono ritenute accettabili. Si ricorre anche spesso a monomeri altamente funzionalizzati e non commercialmente disponibili, preparati attraverso elaborate strategie, per dare più originalità e valore alle librerie focalizzate. Infine, la valutazione preclinica promuove il candidato preclinico, ottenuto dalla precedente fase di ottimizzazione (o un suo analogo estremamente simile), a candidato clinico pronto per lo sviluppo farmaceutico. In questa fase si richiede la preparazione di pochissime entità chimiche, e quindi le tecniche combinatoriali non hanno una grande rilevanza. Usando l'approccio della c. c., possiamo approssimativamente valutare in 1÷2 anni il tempo risparmiato in ricerca farmaceutica per l'identificazione di un candidato clinico, e ciò si accompagna a una significativa riduzione del costo dei singoli composti preparati nell'intera fase. È altrettanto importante sottolineare che la sintesi di un maggior numero di prodotti durante il processo di scoperta e di ottimizzazione di un nuovo principio attivo aiuta a identificare più in fretta eventuali ragioni per bloccare il progetto; questo consente di risparmiare tempo e denaro da investire su progetti che hanno maggior probabilità di successo.

Catalisi

I processi catalitici sono da lungo tempo parte integrante della chimica, in particolare della chimica industriale. La ricerca di nuovi sistemi catalitici, o di sistemi catalitici migliori per reazioni catalizzate, è di estrema attualità in campo sia scientifico sia industriale. Storicamente, gli sforzi di innovazione nel settore si sono sviluppati sulla base della conoscenza acquisita nel passato (sistemi catalitici noti esaminati in nuove reazioni), e, più in generale, in maniera molto pragmatica; la conoscenza teorica generale dei processi catalitici e delle classi strutturali di catalizzatori omogenei ed eterogenei non è paragonabile a quella a disposizione nella ricerca farmaceutica, che si traduce nella progettazione razionale di nuovi farmaci su molti tipi di bersagli molecolari. Le tecniche sintetiche combinatoriali permettono di accumulare un maggior numero di dati relativi all'incidenza di molte variabili importanti nei processi di catalisi (temperatura, concentrazione, solvente, ligandi, natura del catalizzatore ecc.). Questi aiuteranno a comprenderne meglio i principi sottostanti e ad accelerare sia la scoperta di sistemi catalitici nuovi attraverso librerie primarie (analogamente alla ricerca di un principio attivo farmaceutico), sia l'ottimizzazione di sistemi catalitici esistenti attraverso librerie focalizzate (analogamente all'ottimizzazione strutturale del principio attivo nella ricerca farmaceutica). Le prime pubblicazioni riguardanti l'applicazione dell'approccio combinatoriale alla catalisi omogenea o eterogenea sono recenti. Ci si potrebbe chiedere perché metodiche così promettenti siano state applicate per la prima volta alla catalisi più di dieci anni dopo il loro ingresso nella ricerca farmaceutica. La risposta è semplice: mentre saggi biologici ad alta numerosità, per valutare l'attività farmacologica di librerie combinatoriali, erano già disponibili negli anni Ottanta, saggi per misurare l'attività catalitica di librerie di catalizzatori omogenei o eterogenei erano praticamente sconosciuti. Soltanto recentemente si sono registrati dei progressi legati soprattutto allo sviluppo di metodi analitici e di strumentazioni parzialmente o totalmente automatizzati: la resa e la purezza del prodotto di una trasformazione catalizzata possono essere misurati usando la spettroscopia di massa, la spettrometria di risonanza magnetica nucleare, la spettrometria all'infrarosso e la cromatografia liquida, per citare soltanto i metodi più comuni. Molti approcci capaci di combinare creatività scientifica e utilità pratica sono stati riportati in letteratura di recente, e alcune aziende (soprattutto statunitensi) si sono specializzate nella cosiddetta catalisi combinatoria; tuttavia, nonostante i molti progressi, librerie di centinaia di migliaia di individui non sono proponibili per valutazioni accurate e affidabili dell'attività catalitica di ogni loro componente.

Le dimensioni più comuni delle librerie combinatoriali catalitiche variano da poche centinaia a poche migliaia di componenti, quasi sempre preparati come discreti. La loro natura è molto diversa a seconda dello scopo preciso del progetto al quale le librerie si riferiscono. La prima distinzione che si può operare è quella fra le librerie per catalisi omogenea e quelle per catalisi eterogenea: esamineremo brevemente le prime, mentre le seconde saranno trattate successivamente, insieme alle librerie di nuovi materiali. Nella catalisi omogenea sono comuni sistemi catalitici composti da un metallo e da un ligando di coordinazione, la cui efficienza è fortemente condizionata dalla temperatura, dal tipo di solvente e dalla concentrazione del sistema catalitico. Sono stati riportati esempi di librerie che mirano all'ottimizzazione di uno solo dei fattori determinanti ai fini dell'effetto catalitico; il caso più frequente è quello di librerie sintetiche organiche di ligandi, valutate per l'aumento di resa o di purezza del prodotto, o per un aumento di enantioselettività di sintesi di composti chirali. Altre librerie modificano contemporaneamente più di un parametro, fino ad arrivare a permutazioni esaustive di tutte le variabili sopra citate, fermo restando l'obbligo di non eccedere nei numeri per non sovraccaricare il sistema di valutazione dell'efficacia catalitica della libreria. È interessante notare come due componenti di queste ultime librerie possano variare anche soltanto per la concentrazione del catalizzatore, o del ligando, o per la natura del solvente; la loro composizione chimica è quindi identica, ma restano due individui distinti in grado di indirizzare la scelta finale di un sistema catalitico ottimizzato.

Nuovi materiali

Nel 1970 fu pubblicato un lavoro che rappresenta la prima libreria sintetica riportata in letteratura, sia pur costituita da soli tre componenti generati con tecniche di deposizione di miscele di ossidi di metalli, e analizzata per le sue proprietà simultaneamente, ossia in maniera combinatoria. Le tecniche di preparazione di tali materiali, in cui piccole aree della superficie di deposizione differiscono per il maggiore o minore contenuto dei monomeri inorganici scelti, si sono rapidamente evolute, portando a materiali compositi che avrebbero potuto essere concepiti e trattati come vere e proprie librerie combinatoriali inorganiche. Il primo lavoro che applica l'approccio combinatoriale alla ricerca di nuovi materiali inorganici è tuttavia molto più recente: come già per la catalisi, la difficoltà di prevedere la valutazione delle proprietà di una libreria in maniera rapida e accurata per ognuno dei suoi componenti, o meglio per ogni microarea del materiale a strato sottile depositato, ha rallentato lo sviluppo di tecniche sintetiche, analitiche e valutative adeguate.

Ora questo ritardo è stato ampiamente superato e librerie contenenti fino a svariate decine di migliaia di componenti sono state riportate in lavori e brevetti internazionali; in ogni lavoro sono stati identificati e caratterizzati nuovi materiali con proprietà catalitiche, ottiche, paramagnetiche, elettriche (soltanto per citare alcuni settori di grande rilevanza). L'aumentata produttività si è dimostrata importante, considerando che minime variazioni nella composizione in uno dei monomeri, o in uno dei droganti, hanno prodotto proprietà molto diverse nei materiali compositi analizzati; una volta di più la c. c. dà accesso a un numero di dati molto maggiore su cui costruire ipotesi per razionalizzare il comportamento di materiali di diversa composizione. I metodi di valutazione di attività utilizzano tecniche analitiche, spesso combinate con processi e strumenti automatizzati e miniaturizzati: si pensi che le dimensioni di un'intera libreria di un migliaio di composti sono dell'ordine dei 4÷5 cm², e ciò richiede, oltre a un'estrema precisione nella deposizione dei monomeri inorganici componenti la libreria, anche sensibilità e risoluzione spaziale elevatissime della tecnica analitica prescelta per caratterizzare un individuo su una superficie di pochi mm2 senza incorrere in interferenze con altri individui che si trovano a distanze di pochi millimetri.

Nuove prospettive

La ricerca chimica è da sempre parte integrante dell'innovazione e del progresso intesi come miglioramento delle condizioni di vita del genere umano. La c. c. si è rivelata uno strumento prezioso per accelerare la scoperta di nuovi principi attivi in farmacologia. È lecito attendersi ora un periodo in cui approcci combinatoriali prenderanno piede in aree applicative fino a ora in parte trascurate (per es., l'industria cosmetica e quella agroalimentare), e soprattutto un periodo di grandi avanzamenti scientifici e tecnologici. È facile prevedere che automazione e miniaturizzazione faranno progressi tali da permettere la sintesi e la valutazione rapida di librerie numerose, nonché l'isolamento di principi attivi in scala microscopica attraverso un laboratorio delle dimensioni di un transistor per computer, il cosiddetto lab-on-a-chip. Questo laboratorio del futuro avrà spazio in abbondanza nella c. c., con implicazioni oggi inimmaginabili: questa previsione può sembrare azzardata, ma altrettanto azzardato sarebbe stato per un chimico, alla metà degli anni Ottanta del 20° sec., immaginare la sintesi di 25.000 composti inorganici discreti su un supporto solido non più grande di un francobollo, oppure la sintesi e la valutazione biologica di librerie di decine di migliaia di composti organici in una sola settimana.